在前面文章中介绍了两因素方差分析(Two-way ANOVA)的假设检验理论(链接)，本篇文章将实例演示在MedCalc软件中实现两因素方差分析——存在交互作用时的操作步骤。
关键词：MedCalc; 两因素方差分析; 交互作用; 主效应; 单独效应; 简单效应
一、案例介绍
研究A、B两种镇痛药物联合运用在癌症患者中的镇痛效果。药物A取3个剂量：1.0、2.5、5.0 mg；药物B也取3个剂量：5、15、30 μg，共9个处理组。将27例研究对象随机分成9组，每组3例，记录每名对象的镇痛时间Time (min)。试分析A、B两药联合运用的镇痛效果。部分数据见图1，本案例数据可从“附件下载”处下载。
二、问题分析
本案例的分析目的是分析A、B两药联合运用的镇痛效果。临床上，药物之间联合运用往往会相互影响，这种影响可能为正向的增强效应，也可能为反向的拮抗作用。针对这种情况，可以使用多因素方差分析。由于本案例为药物A和药物B两个因素，因此可以使用两因素方差分析。但需要满足6个条件：
条件1：观察变量唯一，且为连续变量。本研究中观察变量只有镇痛时间，且为连续变量，该条件满足。
条件2：有两个因素，且都为分类变量。本研究中有药物A、药物B两个因素，都为分类变量，该条件满足。
条件3：观测值相互独立。本研究中各研究对象的观测值都是独立的，不存在互相干扰的情况，该条件满足。
条件4：观察变量存在显著的异常值，该条件需要通过软件分析后判断。
条件5：各组、各水平观测值为正态(或近似正态)分布，因为本案例中每个组的观察数较少，所以需要使用残差检验整体的正态性。该条件需要通过软件分析后判断。
条件6：相互比较的各处理水平(组别)的总体方差相等，即方差齐同，该条件需要通过软件分析后判断。
三、软件操作及结果解读
(一) 数据准备
- 打开MedCalc软件，导入数据见图2。
- 点击左侧“变量”，出现“变量”对话框，在此处选中需要进行标签设置的变量后点击右侧“属性”(图3)，即可出现“变量属性”对话框。
- 在“变量属性”对话框中设置变量Drug_A和Drug_B的标签，如图4-1和图4-2所示。
(二) 适用条件判断
条件4~6的判断均需要根据方差分析生成的残差进行分析，详见下文“方差分析”部分。
(三) 方差分析
1. 生成模型残差
- 选择“统计”—“方差分析”—“方差双向分析...”(图5)。
- 在“方差双向分析”对话框中，“从属数据”中选择Time,“因子A”中选择Drug_A，“因子B”中选择Drug_B，其他保持默认不变，点击“确定”(图6)。
- 在分析结果最右下角点击“保存残差”，打开“保存残差”对话框(图7)，“选项”下勾选“标准化”，点击确定。在数据视图页面可见生成了一列新的变量“ANOVA_Resid1”，即为模型的标准化残差(图8)。
2. 适用条件判断
(1) 条件4判断(异常值检测)
选择“统计”—“异常值检测”(图9)；将“ANOVA_Resid1”选入“变量”，其他设置见图10。
残差的异常值检测结果(图11)显示，未发现异常值。
(2) 条件5判断(正态性检验)
残差正态性检验结果(图12)显示，W=0.945，P=0.158>0.1，接受正态性，满足条件5。
(3) 条件6判断(方差齐性检验)
误差方差齐性检验结果(图13)显示，F=0.696，P=0.691>0.1，可以认为总体方差齐，满足条件6。
3. 统计描述结果
不同剂量的药物A和药物B镇痛效果的统计描述见图14。药物A为1.0 mg水平，药物B为5、15、30 μg水平时，镇痛时间分别为83.33、100.00、85.00 min；药物A为2.5 mg水平，药物B为5、15、30 μg水平时，镇痛时间分别为：90.00、115.00、135.00 min；药物A为5.0 mg水平，药物B为5、15、30 μg水平时，镇痛时间分别为110.00、95.00和176.67 min。
4. 交互作用判断
点击图12右下方“多重对比图表”，打开“集群多重对比图表”对话框(图15)，“数据”下选择Time，“因子代码”下选择Drug_A，“按因子定义集群”下选择Drug_B，“图表”下勾选“连接线”。
A、B药物不同剂量下镇痛时间图示化结果见图16，可见随着药物A浓度或药物B浓度的增加，镇痛时间未表现出规律的增加或降低趋势，提示两药物之间可能存在交互作用，但还需要依据统计学推断的结果进行判断。
方差分析结果见图17。第三行数据显示了药物A与药物B的交互效应：F=5.073，P=0.006，有统计学意义，可认为药物A和药物B有交互效应。所以不能直接看药物A和药物B的主效应，而要进一步分析各因素的单独效应。
5. 单独效应与事后检验
单独效应，即当其他因素水平固定时，该因素不同水平间的差异。下面将以先固定药物A的剂量为1.0 mg，计算药物B的单独效应为例，介绍单独效应的分析。
【筛选条件的设置】
- 点击左侧“筛选条件”，出现“筛选条件”对话框(图18)后，点击“新建”。
- 打开“筛选条件属性”对话框(图19)，点击“fx”，打开“公式编辑器”对话框(图20)，按照图中显示的操作步骤在“公式”输入框中设置需要筛选的公式：Drug_A=1，然后点击“确定”，即可回到“筛选条件属性”对话框，且可以看到已经设置好的筛选条件(图21)，点击“确定”后回到“筛选条件”对话框(图22)，可见与图18比较，多了一条筛选条件，表明已成功添加了筛选条件。
如果需要设置多个筛选条件(如设置筛选条件“Drug A=2”、“Drug A=3”、“Drug B=1”、“Drug B=2”、“Drug B=3”)以便后期分析，可以再次点击图20中的“新建”新增筛选条件，最终设置6个筛选条件，见图23。此处不做详细介绍。
【单独效应分析】分析步骤同单因素方差分析：
- 选择“统计”—“方差分析”—“方差单向分析...”(图24)。
- 在“方差单向分析”对话框(图25)中，“数据”中选择Time,“因子代码”中选择Drug_B，“筛选条件”中选择Drug_A=1，其他保持默认不变，点击“确定”。
方差分析结果(图26)显示，F=0.910，P=0.452，可以认为当药物A为1.0 mg时，不同剂量的药物B的镇痛效果差异无统计学意义。
参照以上变量筛选和单因素方差分析方法，可以得到当固定药物A的剂量为2.5 mg时，不同剂量的药物B镇痛效果的方差分析结果(图27)，发现F=3.894，P=0.082，可认为此时不同剂量的药物B镇痛效果差异无统计学意义。
当固定药物A的剂量为5.0 mg时，不同剂量的药物B镇痛效果的方差分析结果为F=11.466，P=0.009，可以认为不同剂量的药物B镇痛效果差异有统计学意义(图28)。
进一步查看下方的成对比较结果(图29)可知，药物B第一组(5.0 μg)和第三组(30.0 μg)差异均有统计学意义(P<0.05)，第二组(15.0 μg)和第三组(30.0 μg)之间的差异也有统计学意义(P<0.05)。从均数可以看出，第一组的[(110.00±21.79) min]显著低于第三组[(176.67±15.28) min]，第二组的均数[(95.00±27.84) min]显著低于第三组[(176.67±15.28) min]。可认为当药物A剂量为5.0 mg时，药物B组剂量为15.0 μg时镇痛时间最短，剂量为30.0 μg时镇痛时间最长。
当固定药物B的剂量为5.0 μg时，不同剂量的药物A镇痛效果的方差分析结果(图30)显示，F=1.276，P=0.345，可认为此时不同剂量的药物A镇痛效果差异无统计学意义。
当固定药物B的剂量为15.0 μg时，不同剂量的药物A镇痛效果的方差分析结果(图31)显示，F=0.619，P=0.570，可认为此时不同剂量的药物A镇痛效果差异无统计学意义。
当固定药物B的剂量为30.0 μg时，不同剂量的药物A镇痛效果的方差分析结果(图32)显示，F=33.955，P=0.001，可认为此时不同剂量的药物A镇痛效果差异无统计学意义。
进一步查看下方的成对比较结果(图33)可知，药物A第一组(1.0 mg)和第二组(2.5 mg)、第三组(5.0 mg)差异均有统计学意义(P<0.05)，第二组(2.5 mg)和第三组(5.0 mg)之间的差异也有统计学意义(P<0.05)。从均数可以看出，第一组的均数[(85.00±10.00) min]显著低于第二组[(135.00±15.00) min]和第三组[(176.67±15.28) min]，第二组的均数[(135.00±15.00) min]显著低于第三组[(176.67±15.28) min]。可以认为当药物B剂量为30.0 μg时，药物A组随着剂量的增高，镇痛时间显著增加。
结合以上单独效应分析与事后检验结果和复式误差条形图(图17)，可以直观且清晰地了解到不同剂量的药物A和药物B的各个剂量的镇痛效果和相互之间的关系。
四、结论
本研究采用两因素方差分析探讨A、B两种镇痛药物联合运用在产妇分娩时的镇痛效果。数据不存在异常值，残差服从正态分布，总体方差相等；通过两因素方差分析发现两药物之间存在交互作用(FDrug_A*Drug_B=5.073，P=0.006)，所以进行单独效应分析。
药物A为1.0 mg水平，药物B为5.0、15.0、30.0 μg水平时，镇痛时间分别为83.33、100.00、85.00 min；药物A为2.5 mg水平，药物B为5、15、30 μg水平时，镇痛时间分别为90.00、115.00、135.00 min；药物A为5.0 mg水平，药物B为5、15、30 μg水平时，镇痛时间分别为110.00、95.00、176.67 min。
药物A的单独效应分析显示，在药物B为30.0 μg水平时，药物A各水平之间的镇痛时间差异有统计学意义(F=33.955，P<0.001)。经过事后两两比较发现，药物A 各水平两两比较后的镇痛时间差异均有统计学意义(P>0.05)。对药物A从1.0 mg至2.5mg时均数增加了50.00 min，从1.0 mg至5.0 mg时增加了91.67 min，从2.5 mg至5.0 mg时增加了41.67 min。表明在药物B为30.0 μg水平时，随着药物A浓度的增加，镇痛时间呈上升趋势。
药物B的单独效应分析显示，药物A为1.0 mg和2.5 mg水平时，药物B各水平之间的镇痛时间差异无统计学意义(P>0.05)；但在药物A为5.0 mg水平时，药物B各水平之间的镇痛时间差异有统计学意义(P<0.05)。事后两两比较结果显示，当药物A为5.0 mg时，药物B浓度5.0 μg与15.0 μg比较、5.0 μg与30.0 μg比较，镇痛时间差异有统计学意义(P<0.05)，30.0 μg与15.0 μg比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
综上可知，对产妇分娩时镇痛，A、B两种药物联合运用时会相互影响，随着药物浓度的增加，联合作用趋于复杂和不稳定。
五、分析小技巧
【正态性检验】
两因素或多因素方差分析时，有两种选择来测试正态性：
- 若每组样本量较大且组别较少时，可使用原始数据检查每组的正态性
- 若组别较多或每组样本量较小时，可使用残差检查整体的正态性
【交互作用判断】
两因素方差分析时，需要首先判断两个因素之间是否存在交互作用。
- 若交互作用有统计学意义，则需要分析单独效应。此时，单纯研究某个因素的作用并无意义，应分别探讨另一个因素不同水平时对该因素的作用。
- 若交互作用无统计学意义，说明两因素的作用彼此独立，逐一分析各因素的主效应即可；计算主效应时，在模型中仍需要保留交互项。